真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷-3真菌體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

真菌體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

衛(wèi)生部北京醫(yī)院 胡云建

一、肉湯稀釋法

肉湯稀釋法包括微量和宏量，宏量法操作比較麻煩，微量法應(yīng)用較多。

（一）原理

微量肉湯稀釋法，按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的 96 孔聚苯乙烯板中，在特定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，讀取能完全或顯著抑制真菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。

（二）適用菌種

酵母菌及絲狀真菌，雙向真菌。

（三）酵母菌和絲狀真菌肉湯稀釋法藥敏方法比較

培養(yǎng)基都是用 PRMI1640 培養(yǎng)基；抗菌藥物基本一致；檢測(cè)菌株的傳代，酵母菌接種于沙氏培養(yǎng)基 35 ℃孵育 24h( 念珠菌 ) 或 48h （隱球菌），至少傳代 2 次，大多數(shù)絲狀真菌在土豆葡萄糖培養(yǎng)基中 35 ℃先孵育 7 天，鐮刀菌則須先在培養(yǎng)基中 35 ℃孵育 2-3 天，然后再于 25 到 28 ℃孵育至第七天，不同菌種孵育的時(shí)間是不一樣的；然后接種濃度，酵母菌是 0.5 × 10 3 -2.5 × 10 3 CFU/ml ，絲狀真菌是 0.4 × 10 4 -5 × 10 4 CFU/ml ；接種的方法微量法和宏量法相近，宏量法都是 0.1ml 藥液加 0.9ml 菌液，微量法是 0.1ml 的藥液加 0.1ml 的菌液；孵育條件，新型隱球菌一般是 35 ℃空氣孵育 70-74 小時(shí)，其它酵母菌是 35 ℃空氣孵育 46-50 小時(shí)，根霉菌屬是 35 ℃空氣孵育 21-26 小時(shí)，鐮刀菌屬、曲霉菌屬、申克氏孢絲菌是 35 ℃空氣孵育 46-50 小時(shí)，波氏假阿利什菌 35 ℃空氣孵育 70-74 個(gè)小時(shí)；判讀與生長(zhǎng)對(duì)照比較，兩性霉素 B 要 100% 的抑制，氟胞嘧啶和唑類(lèi)是 80% 抑制，絲狀真菌的結(jié)果與酵母菌類(lèi)似，兩性霉素 B 是 100% 的抑制，氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑是 50% 的抑制，就說(shuō)這個(gè)的話跟那個(gè)酵母菌不一樣它是 50% 的抑制，新三唑類(lèi)（伊曲康唑、泊沙 康唑、伏立康唑）是 100% 的抑制。

（四）微量肉湯稀釋法

1 、檢測(cè)藥物

還有阿尼芬凈，卡泊芬凈，米卡芬凈等。

2 、質(zhì)控菌株

（ 1 ）酵母菌

近平滑念珠菌 ATCC22019 ；克柔念珠菌 ATCC6528 。

（ 2 ）絲狀真菌

多變擬青霉 ATCC MYA-3630 ，黃曲霉 ATCC204304 ，煙曲霉 ATCC MYA-3626 ，煙曲霉 ATCC MYA-3627 ，黃曲霉 ATCC MYA-3631 ，土曲霉 ATCC MYA-3633 ，串珠鐮刀菌 ATCC MYA-3629 ，茄病鐮刀菌 ATCC3636 ，尖端賽多孢菌 ATCCMYA-3635 ，尖端賽多孢菌 ATCCMYA-3634 。

3 、結(jié)果判讀

（ 1 ）酵母菌

兩性霉素 B ， 100% 抑制；唑類(lèi)、棘白菌素和 5- 氟胞嘧啶， 80% 抑制。

（ 2 ）絲狀真菌

兩性霉素 B 、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑： 100% 抑制；氟康唑、氟胞嘧啶， 50% 抑制；棘白菌素類(lèi)藥物讀 MEC 值，即讀取與生長(zhǎng)對(duì)照孔的菌絲生長(zhǎng)相比，出現(xiàn)小的、圓形、緊縮的菌絲生長(zhǎng)時(shí)最低藥物濃度。

酵母菌 MICs 生長(zhǎng)對(duì)照良好，建議 24h 讀??；大部分酵母菌， 24h MIC 和 48h MIC 差別較??；某些菌種而言， 24h MIC 似乎與臨床關(guān)系更加一致，且 24h MIC 更加便于指導(dǎo)臨床及時(shí)用藥；對(duì)于某些拖尾生長(zhǎng)的菌株（大約 5% ）， 48h 的孵育時(shí)間會(huì)使藥敏結(jié)果由敏感變?yōu)槟退?，而體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)這部分菌株對(duì)藥物是敏感的。

4 、 CLSI 真菌體外藥敏折點(diǎn)制定原則

根據(jù)不同藥物進(jìn)入體內(nèi)后血液中最高濃度 (Cmax) 與該藥物體外最低抑菌濃度 (MIC) 間的關(guān)系，如（一般情況）： S ， MIC ＜ 1/4-1/8 Cmax ； SDD ， MIC ＜ 1/2-1 Cmax ； R ， MIC ＞ Cmax 。

SDD 是指 MIC 值與血液濃度相似或稍低于 Cmax ，可以加大藥物的用量，藥物到體內(nèi)的濃度會(huì)增加，此時(shí)用這個(gè)藥物進(jìn)行治療還是敏感的也叫 SDD ，即抗生素依賴(lài)性。

（五）改良微量肉湯稀釋法

1 、原理

半固體培養(yǎng)基中檢測(cè)藥物敏感性，與生長(zhǎng)對(duì)照相比，通過(guò)生長(zhǎng)濁度判定 MIC 值；或使用 Alamar Blue 指示劑，檢測(cè)培養(yǎng)基中真菌生長(zhǎng)引起的氧化還原電勢(shì)的改變，利用指示劑的顏色改變判讀 MIC 值。

例如： ATB Fungus 3 ； VITEK-2 ： YeastOne 。

2 、 ATB FUNGUS 3

標(biāo)準(zhǔn) : 遵循 EUCAST 和 CLSI 標(biāo)準(zhǔn)；

判讀方便 : 可肉眼判讀，也可 ATB 自動(dòng)判讀；

全面 : 涵蓋抗真菌感染治療常用藥物。

3 、判讀唑類(lèi)結(jié)果

氟康唑，伊曲康唑，伏立康唑， MIC 值為得分為“ 2, 1 或 0 ”的最小濃度。

5- 氟胞嘧啶的藥物是 SIR ，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑是 SSDDR ，目前對(duì)兩性霉素沒(méi)有判斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于新型隱球菌來(lái)說(shuō)， 5- 氟胞嘧啶有判斷值，氟康唑有判斷值，但是兩性霉素 B 、伊曲康唑、伏立康唑沒(méi)有折點(diǎn)。

4 、判讀難點(diǎn)

在做真菌藥敏條時(shí)，要注意拖尾現(xiàn)象。

在唑類(lèi)藥物孔中的微弱生長(zhǎng) ( 得分 = 1 或 2) 導(dǎo)致對(duì) MIC 值高可能被誤判為耐藥。例如 : 氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑孔中都有拖尾生長(zhǎng)。但對(duì)于兩性霉素來(lái)說(shuō)，一定要注意邊緣生長(zhǎng)。 AMB: 應(yīng)得分 1, ； FCA, ITR 或 VRC: 應(yīng)得分 0 或 1 。

例如 : 孔 0.5 和 1 => 得分 =1 。

二、 Etest 法

Etest 法是改良的瓊脂擴(kuò)散法，預(yù)先制備的含梯度抗生素藥物濃度的試紙條。貼在已涂布真菌的平板后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育，不同濃度的抗真菌藥物擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基中，通過(guò)抑制真菌生長(zhǎng)而產(chǎn)生抑菌環(huán)，根據(jù)抑菌環(huán)大小可以讀出相應(yīng)藥物的最小抑菌濃度（ MIC ）值。

（一）培養(yǎng)基

常用 RPMI 1640+MOPS+2% 葡萄糖 +1.5%Bacto 瓊脂。

（二）菌種

常見(jiàn)酵母菌，曲霉菌，鐮刀菌，根霉屬。

（三）藥物

常用兩性霉素 B ，氟胞嘧啶，伊曲康唑，氟康唑，泊沙康唑，伏立康唑，阿尼芬凈，卡泊芬凈等。

（四）結(jié)果判讀

兩性霉素 B ： 100% 生長(zhǎng)抑制； 5- 氟胞嘧啶： 95 ％抑制處；唑類(lèi)藥物： 80 ％抑制處。

（五）質(zhì)控菌株

近平滑念珠菌 ATCC22019 ；克柔念珠菌 ATCC6528 ；白念珠菌 ATCC90028 。

不同的藥物、不同的菌種讀法有區(qū)別，因此遇到相應(yīng)的細(xì)菌一定要仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。

三、 抗真菌藥敏紙片法

（一）紙片擴(kuò)散法（ CLSI M44-A ）

抗真菌的藥物有氟康唑和伏立康唑，培養(yǎng)基為 MH 瓊脂 +2% 的葡萄糖 +0.5ug/ml 的美蘭， ph 值 7.2-7.4 ，檢測(cè)菌接種于沙氏培養(yǎng)基 35 ℃孵育 24h ，至少傳代 2 次。接種量的濃度是 0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬丫壕鶆虻赝坎荚诃傊希?15 分鐘之內(nèi)要貼上抗真菌藥物的紙片，然后再在 35 ℃的孵箱孵育 20-24h ，然后用卡尺盡量取菌量明顯減少處的抑菌直徑，忽略抑菌圈內(nèi)少量細(xì)菌生長(zhǎng)。

氟康唑的敏感值是大于等于 19mm ， SDD 是 15-18mm ， R 是小于等于 14mm; 伏立康唑是 1ug/ 片，大于 17mm 就是敏感，小于 13mm 就是耐藥， 14-16 是 SDD 抗菌素依賴(lài)。

SDD: 菌株的 MIC 接近于常規(guī)劑量給藥時(shí)血中或組織能達(dá)到的藥物濃度，治療反應(yīng)性低于敏感菌株。此類(lèi)菌株對(duì)藥物的敏感性取決于藥物所能達(dá)到的最大血液濃度。該范圍還作為一緩沖區(qū)，避免由于微小技術(shù)誤差導(dǎo)致的結(jié)果錯(cuò)誤解釋。

（二） Rosco 抗真菌藥敏紙片法

Rosco 抗真菌藥敏紙片法是改良的瓊脂擴(kuò)散法，預(yù)先制備的含梯度抗生素藥物濃度的試紙條。貼在已涂布真菌的平板后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育，不同濃度的抗真菌藥物擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基中，通過(guò)抑制真菌生長(zhǎng)而產(chǎn)生抑菌環(huán)，根據(jù)抑菌環(huán)大小可以讀出相應(yīng)藥物的最小抑菌濃度（ MIC ）值。

培養(yǎng)基：改良 Shadomy 培養(yǎng)基或 RPMI-1640 培養(yǎng)基

菌種：酵母菌，

藥物：兩性霉素 B ，氟康唑， 5- 氟胞嘧啶，伊曲康唑，伏立康唑，卡泊芬凈 ，泊沙康唑等；

結(jié)果判讀：兩性霉素 B ：生長(zhǎng)完全抑制處；三唑類(lèi)、咪唑類(lèi)、卡泊芬凈：量取至有正常大小菌落生長(zhǎng)的抑菌環(huán)的大小；

質(zhì)控菌株：白念珠菌 ATCC 64548 ，白念珠菌 ATCC 64550 ，近平滑念珠菌 ATCC 22019 ，克柔念珠菌 ATCC 6258 。

四、真菌藥敏試驗(yàn)的臨床價(jià)值和局限性

真菌藥敏試驗(yàn)的臨床價(jià)值，目前有一個(gè)共識(shí)為“ 90-60 ”原則。“ 90-60 ”原則，即體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果敏感者約有 90% 臨床療效較好，而體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果耐藥者約有 60% 仍然對(duì)治療有效?？拐婢乃幟粼囼?yàn)遠(yuǎn)不如細(xì)菌藥敏試驗(yàn)完善，不是所有抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)都獲得體外試驗(yàn)和體內(nèi)療效的一致性，體外耐藥的藥物不一定治療失敗。因此真菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值是因藥而異，需要分別考慮。

實(shí)踐證明，氟康唑?qū)δ钪榫碗[球菌的體外抗菌活性與氟康唑治療念珠菌病的體內(nèi)療效一致性非常好。

真菌實(shí)驗(yàn)各個(gè)醫(yī)院有不同看法，但有些情況需做真菌藥敏試驗(yàn)，如治療失敗再做藥敏試驗(yàn)；復(fù)發(fā)性念珠菌病時(shí)；念珠菌血癥及深部真菌感染，應(yīng)做唑類(lèi)藥物的真菌藥敏試驗(yàn)；當(dāng)深部真菌感染要延長(zhǎng)治療，對(duì)所有分離真菌做藥敏試驗(yàn)。

臨床療效與體外藥敏差異的來(lái)源有多種因素，如無(wú)局部感染體外藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，用系統(tǒng)用藥標(biāo)準(zhǔn)代替 , 造成最大的差異； NCCLS 推薦方法與認(rèn)可方法間的差異；終點(diǎn)判讀產(chǎn)生大誤差；未找到真正致病菌等。

真菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)存在差異，目前 NCCLS 制定的藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)是以不同藥物進(jìn)入體內(nèi)后血液中最高濃度與該藥物體外最低抑菌濃度（ MIC ）間的關(guān)系所制定，如（一般情況）： MIC< 最高血液濃度 4-8 倍為， S ； MIC< 最高血濃度 1-2 倍為 ， I ； MIC> 最高血濃度為， R 。

目前依舊存在的待解決的問(wèn)題，如抗真菌藥物在個(gè)各局部組織分布濃度與血液不同，甚至高幾倍或幾十倍，局部用抗生素的抗真菌藥物的藥敏標(biāo)準(zhǔn)是什么 ? 局部用抗真菌的藥物是否不必進(jìn)行試驗(yàn) , 而憑經(jīng)驗(yàn)用藥 ? 局部用藥依賴(lài)體外抗生素試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性 ? 還需要要更多的研究更多的數(shù)據(jù)來(lái)解釋這方面的關(guān)系。

MIC 真菌藥敏更有參考價(jià)值。因?yàn)榫植空婢腥驹趨⒖颊婢幟艚Y(jié)果的同時(shí)還應(yīng)根據(jù)不同藥物在不同組織中的藥代特征，蓄積濃度， MIC 與蓄積濃度的關(guān)系、抗真菌譜等考慮其有效性和病人對(duì)抵抗不良反應(yīng)的能力來(lái)選擇抗真菌的藥物。在藥物濃縮部位感染時(shí)，即使 I 或 SDD 的藥物也有應(yīng)用價(jià)值或者在加大劑量后有應(yīng)用的價(jià)值。真菌藥敏報(bào)告應(yīng)同時(shí)參考 S 、 I 、 R 和 MIC 值， MIC 結(jié)果可結(jié)合組織濃度判斷藥物的有效性 , 在局部真菌感染的時(shí)候更應(yīng)依據(jù) MIC 和組織藥物濃度來(lái)判斷敏感性。

真菌治療依據(jù)，鑒定到種，根據(jù)藥物耐藥譜指導(dǎo)用藥有很好的預(yù)測(cè)性。如土曲菌、枝頂孢霉、尖端賽多孢、足分支霉對(duì)兩性霉素 B 耐藥。

臨床有個(gè)很好列子就是熱病，如：—無(wú)活性； +/ —可能有活性； + 有活性，三線（至少臨床有效）； ++ 有活性，二線（作用稍差）； +++ 有活性，一線（常常有效）。如果對(duì)光滑念珠菌氟康唑和伊曲康唑的活性就不一定好，真正要治療光滑念珠菌引起感染 +++ 時(shí)，可以選擇棘白菌素類(lèi)，所以一定要具體了解常用藥物最常見(jiàn)的菌類(lèi)抗真菌的活性。

聲明：以上內(nèi)容來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，若有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們，立即刪除！所有的觀點(diǎn)由網(wǎng)友個(gè)人想法，不代表本公司也持此立場(chǎng)，感謝大家支持！

重慶英沐教育科技有限公司

YMU教育

重慶YMU教育_醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育學(xué)分卡

重慶YMU教育_小學(xué)初中高中教育課后輔導(dǎo)

重慶YMU教育_執(zhí)業(yè)醫(yī)師護(hù)士藥師資格考試考前輔導(dǎo)

www.kawsbarofficials.com

www.ymujiaoyu.com

YMU教育(www.kawsbarofficials.com)，全國(guó)熱線電話：023-89119533；提供繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分、中小學(xué)課后輔導(dǎo)、美年大健康·慈銘體檢大牌定制健康體檢等服務(wù)；